Proizvodnja i imobilizacija mikrobnih β-galaktozidaza za primenu u transgalaktozilacionim reakcijama

Abstract

U okviru ove doktorske disertacije ispitan je veliki broj mikroorganizama iz kolekcije kultura Tehnološko-metalurškog fakulteta Univerziteta u Beogradu u cilju izbora najefikasnijeg producenta β-galaktozidaze. Kao najbolji producent sa aspekta aktivnosti, ali i karakteristika dobijenog enzima izdvojila se probiotska vrsta Lactobacillus acidophilus. Stoga, u cilju poboljšanja procesa produkcije β- galaktozidaze, u nastavku rada izvršena je detaljna optimizacija sastava hranljivih podloga, parametara procesa proizvodnje, kao i izolovanja enzima. Okarakterisana su najbitnija svojstva izolovane β-galaktozidaze iz L. acidophilus (tremperaturna i pH aktivnost/stabilnost, kinetički parametri) na osnovu čega je potom upoređena sa komercijalnim preparatom β-galaktozidaze iz A. oryzae. Oba enzima primenjena su u reakciji transgalaktozilacije za sintezu galakto-oligosaharida. )majući u vidu kompleksnost ove reakcije, identifikovani su i ispitani uticaji ključnih reakcionih parametara: koncentracije enzima i laktoze, kao i vremena trajanja reakcije. Pored optimizacije prinosa, određena je i detaljna struktura dobijenih galaktooligosaharida. U tu svrhu razvijena je brza i efikasna jednostepena metoda primenom spektrometrije jonske pokretljivosti spregnute sa masenom spektroskopijom (IMS/MS). Ustanovljeno je da galakto-oligosaharidi dobijeni u reakcijama katalizovanim pomoću β-galaktozidaze iz A. oryzae uglavnom sadrže β(1→6) i β (1→3) glikozidne veze, dok galakto-oligosaharidi dobijeni pomoću β- galaktozidaze iz L. acidophilus sadrže β(1→6) i β(1→4) veze. Takođe, utvrđeno je da su dobijeni proizvodi različitih stepena polimerizacije, ali i što je najbitnije da se udeo pojedinih veza menja sa vremenom reakcije. U cilju poboljšanja stabilnosti ispitivanih enzimskih preparata, i njihove implementacije u kontinualnim reaktorskim sistemima, izvršena je imobilizacija enzima na čvrste nosače. )spitano je više modifikovanih i nemodifikovanih nosača za imobilizaciju različitih karakteristika posredstvom različitih mehanizama vezivanja, pri čemu je pokazano da su za imobilizaciju oba enzima najpogodniji nosači sa primarnim amino grupama, koje omogućavaju adsorbciju enzima elektrostatičkim interakcijama. Najbolji rezultati u slučaju komercijalnog enezima iz A. oryzae postignuti su sa komercijalnim nosačem Purolite® A109, pri čemu je postignuto znatno unapređenje procesa hemijskom aktivacijom karboksilnih grupa na površini enzima, što je dovelo do formiranja kovalentnih veza između nosača i enzima. Ovom imobilizacijom postignuto je značajno povećanje termičke i operativne stabilnosti, ali i povećanje specifičnosti prema reakciji transgalaktozilacije. Sa druge strane, izolovani enzim iz L. acidophilus uspešno je imobilisan na komercijalni nosač Lifetech ECR8409. Imobilisani preparati β-galaktozidaza potom primenjeni su u šaržnom i bioreaktoru sa fluidizovanim slojem enzima i recirkulacijom supstrata. U oba reaktora izvršena je optimizacija relevantnih procesnih parametara, a rezultati su pokazali da se reakcije u oba enzima odvijaju približno jednakom brzinom, ali je stabilnost enzima i reaktoru sa fluidizovanim slojem povećana, pa se imobilisani enzim može koristiti u većem broju reakcionih ciklusa. U poslednjem delu ove doktorske disertacije, ispitana je mogućnost korišćenja alternativnih akceptora galaktozil ostataka, salicina i sorbitola, u reakciji transgalaktozilacije, pri čemu kao proizvod reakcije nastaju nova fiziološki aktivna jedinjenja. Oba enzima pokazala su visok afinitet prema sintezi novih proizvoda, a osnovni parametri reakcije optimizovani su primenom metode statističkog planiranja eksperimenata, pri čemu su ustanovljeni najznačajniji uticaji ključnih parametara, ali i njihove međusobne interakcije. U oba slučaja utvrđeno je da su najbolji prinosi postignuti pri visokim koncentracijama laktoze, kao i u prisustvu akceptora (salicina ili sorbitola) u višku.