Effect of the duration of liquid nitrogen storage on the regrowth of blackberry cryopreserved by droplet vitrification

Abstract

In vitro shoot tips of the blackberry cultivar 'Čačanska Bestrna' were cryopreserved using the droplet vitrification technique. Upon loading (30 min) in a solution of 1.9 M glycerol and 0.5 M sucrose, the explants were dehydrated for 40 min on ice with the PVS A3 vitrification solution (glycerol 37.5%, dimethyl sulfoxide 15%, ethylene glycol 15% and sucrose 22.5%) and for 40 min at room temperature with the PVS3 solution (glycerol 50% and sucrose 50%). They were subsequently frozen in individual microdroplets of vitrification solution, by direct immersion in liquid nitrogen (LN), and kept therein for 2, 4, 8 and 24 h. The explant rewarming was performed in an unloading solution (0.8 M sucrose) for 30 min at room temperature. The duration of LN exposure did not exert significant effects on the survival and regrowth of explants in both types of vitrification solutions. The survival and regrowth of cryopreserved shoot tips dehydrated with PVS3 solution ranged between 90-95% and 80-90%, respectively. However, dehydration with PVS A3 resulted in a lower survival rate (80-90%) and a considerably lower regrowth rate (55-65%) of explants. Monitoring the shoots regenerated in the in vitro culture revealed their normal capacity for multiplication and rooting in comparison with the controls, which fully confirms the purpose of cryopreservation in the long-term preservation of plant material.

Vrhovi in vitro izdanaka sorte kupine Čačanska bestrna su krioprezervirani primenom tehnike "droplet" vitrifikacija. Po završenom osmotskom tretmanu (30 min) u rastvoru sa 1,9 M glycerolom i 0,5 M saharozom, eksplantati su dehidrirani 40 min na ledu vitrifikacionim rastvorom PVS A3 (glicerol 37,5%, dimetil sulfoksid 15%, etilen glikol 15% i saharoza 22,5%) ili 40 min na sobnoj temperaturi PVS3 rastvorom (glicerol 50% i saharoza 50%). Eksplantati postavljeni u kapljice vitrifikacionog rastvora na aluminijumskoj foliji su direktno uranjani u tečni azot gde su držani 2, 4, 8 i 24 h. Osmotska rehidracija je vršena 30 min u rastvoru sa 0,8 M saharozom, na sobnoj temperaturi. Dužina čuvanja eksplantata u tečnom azotu nije imala značajan uticaj na procenat preživljavanja i regeneracije eksplantata dehidriranih sa oba vitrifikaciona rastvora. Preživljavanje i regeneracija eksplantata koji su dehidrirani sa PVS3 su iznosili 90-95% i 80-90%, resp. Međutim, dehidracija sa PVS A3 je rezultirala nižim procentima preživljavanja (80-90%) i regeneracije (55-65%) eksplantata. Praćenjem regenerisanih izdanaka u in vitro kulturi utvrđeno je da oni imaju normalan kapacitet za multiplikaciju i ožiljavanje u poređenju sa kontrolnim izdancima čime je u potpunosti potvrđena svrha krioprezervacije za dugotrajno čuvanje biljnog materijala.